《微生物学实验》课程大纲

（一）本课程实验总体介绍

1、本课程实验的任务：

微生物学实验是生物产业学院各专业教学大纲拟定的一门共同的专业基础平台实验课，要求各专业的学生通过普通微生物学实验课的学习，达到以下三个目的：其一：使学生做到理论与实践的统一，有目的引导学生把所学到的普通微生物学理论知识在实验实践教学环节中加以验证和应用，做到理论与实践紧密结合，体现微生物学实验教学特色；其二是在实验教学中，教师以身作则，培养学生良好的实验习惯，树立实事求是的严谨科学作风；其三是让学生在掌握微生物学实验的基本原理基础上，全面掌握微生物学基本实验操作技能，为后续各专业课奠定坚实的物质基础。

2、本课程实验简介：

普通微生物学实验包括两方面实验教学内容：

其一：微生物形态学实验教学，通过这部分实验教学，要求学生熟练掌握显微镜的使用技能，掌握细菌、放线菌、霉菌及酵母菌的显微形态特征；让学生掌握微生物的无菌操作、细菌单染色及特殊染色法、微生物的死活细胞染色鉴定以及微生物的显微计数等基础微生物学实验操作技能。

其二：微生物在实践环节中的应用，通过这部分实验教学，要求学生掌握微生物培养基的制备原理，培养基础的分类与应用，培养基的制备方法；掌握消毒与灭菌的原理，微生物研究及应用中，常用的消毒与灭菌方法的原理及操作方法；掌握微生物的分离与纯化的原理及常用分离纯化方法；掌握微生物菌种保存的原理与方法，掌握常用的微生物菌种的转接种操作技能。

3、本课程适用专业：

本实验课面向生物产业学院各专业学生开设，其中包括本科的生物工程、制药工程、食品科学工程及药学工程；专科包括生物化学技术，商品检测专业。

4、本课程实验涉及核心知识点：

通过实验教学环节，正确引导学生把所学到的微生物学理论知识在实验中加以验证和应用，使学生对微生物学专业基础课所学理论知识在实验实践教学环节中得以重新认识、理解和深化。在实验教学环节中，加强对学生动手能力的培养；督促学生养成良好形为习惯，提高实验综合能力，培养造就具备综合性素质的应用性人才。

5、本课程实验重点与难点：

在确保为学生提供良好的实验条件和环境前提下，在现有微生物学实验设备资源有限条件下，尽最大可能，调动一切实验仪器设备资源，在实验实践操作环节中，保障有充足的仪器设备台套件数供学生独立操作使用。

在实验教学环节中，如何加强对学生动手能力的培养：让学生从掌握生物化学实验常规仪器设备结构原理基础入手，通过大量反复的操作实践训练，使学生不仅会按规范化操作程序独立操作、使用生化实验中常规仪器设备，而且要求学生掌握常规仪器设备的主要性能参数，并能简单维护仪器设备。

在实验教学环节中，督促学生养成良好形为习惯，提高实验综合能力，培养造就具备综合性素质的应用性人才。

（1）.规范学生微生物学实验报告书写格式：用成都大学统一报告纸书写；每个实验必需写明实验名称，实验目的和原理（应包括实验名称、操作简述、现象纪录、微生物显微绘图）；回答实验思考题。

（2）.将实验规范操作作为评定学生实验成绩考核目标：在实验中，全程跟踪学生实验操作，评定学生实验操作成绩。

（3）.要求学生以严谨的治学态度对待每一次实验：强化学生微生物实验操作技能的培养，并在学期末通过微生物划线分离与微生物斜面接种的实际操作考核，与实验报告的平时成绩结合，客观公正地综合评定学生的微生物学实验成绩。

6、考核方式：

实验报告成绩：70%；

实验操作规范：10%；

期末实验考核：20%。

7、总学时：

24学时。

8、教材名称及教材性质：

《微生物学实验》自编实验教学讲义。

9、参考资料：

为了使实验教学大纲科学而严谨，在实验教学大纲编写中，主要参考和借鉴以下参考书目，在此对下述所列参考书目的编著者及其出版社一并表示衷心的感谢。

(1). 《微生物学实验》（范秀容，李广武，沈萍编著）·北京：高等教育出版社；

(2). 《微生物学实验》（徐文俊编写）（自编教材）·成都大学生物产业学院。

（二）包含实验项目基本信息

实验项目一

1、实验项目名称：

普通光学显微镜的结构和使用；细菌的显微形态形态特征观察。

2、实验项目性质：

验证性。

3、实验要求：

必修。

4、学时数：

3学时。

5、实验内容：

(1).普通光学显微镜的基本构造及使用技巧：

①结合所使用的显微镜讲解其机械装置和光学系统两大组成部分功能。

②向学生讲解在微生物实验中常用的显微镜镜头的配置及应用：

低倍观察时镜头组合为：目镜可选择5x 10x 16x，物镜通常选用10x，组合后放大倍数依次为50，100,160倍，适用于真菌，霉菌，血细胞，酵母菌等真核微生物形态观察及计数用。

高倍观察时镜头组合为：目镜16x，物镜40x，组合后放大倍数为640倍，这组镜头配置适用于细菌，放线菌的形态观察。

油镜观察时镜头组合为：目镜16x，物镜选用100x的油镜，组合后放大倍数可达1600倍，这样的镜头组合适于细菌，放线菌形态特征的更清晰地观察。

③向学生详细讲解油镜的工作原理及其正确的使用方法。

④向学生讲解显微镜的使用技巧，以便让学生能尽可能快速地熟练掌握在微生物形态观察中，显微镜的操作技能：在显微镜的正常操作中，如何进行光圈大小，光线强弱调节以及物镜的转换；向学生说明在实际操作中，普通光学显微镜在出现不同步时，如何直接调节高位镜迅速观察到需要观察的微生物。

(2).细菌（球菌，杆菌）的个体形态显微特征对比观察

①观察细菌个体形态特征的基本要领是：所使用的显微镜的视野必需明亮，先在低倍镜下寻找到需观察的菌体，再换用高倍镜或在油镜下观察菌体的个体形态。

②观察菌体形态时，应避开相互重叠菌体，以单独游离的单个菌体为观察目标。

③将观察到的球菌，杆菌在实验报告上按正规的微生物作图方法描绘出来。

(3).讲解微生物作图的规范要求及微生物实验报告的书写要求。

6、项目需用仪器设备名称：

7、所需主要元器件及耗材：

8、实验项目目的和任务：

(1).掌握普通光学显微镜的构造及各部分的功能，能灵活使用显微镜进行低倍物镜、高倍物镜及油镜之间转换调节。

(2).掌握油镜的放大工作原理及正确的操作使用方法。

(3).通过显微镜，用实验室提供的教学装片，观察球菌及杆菌的显微形态特征，并掌握微生物绘图的方法和技巧。

编写责任人：    彭镰心               审核人：        邹亮        

编写时间：2011 年 8  月 28  日       审核时间： 2011 年 9  月 2日

实验项目二

1、实验项目名称：

细菌的单染色法及芽孢染色法

2、实验项目性质：

验证性。

3、实验要求：

必修。

4、学时数：

3学时。

5、实验内容：

(1).微生物的无菌操作

首先向学生讲解微生物无菌操作的基本原理以及在微生物实验及科研工作中进行无菌操作的必要性及可行性。

结合实验教材P9l图2－1无菌操作示意图，向学生讲解微生物无菌操作的基本步骤；重点向学生作无菌操作规范化的演示示范。

(2).细菌的培养特征

细菌的培养特征有多种：细菌在固体培养基上的培养特征；细菌在半固体培养中的培养特征；细菌在明胶培养基中的培养特征；细菌在液体培养基中的培养特征。这些培养特征均可以用来鉴定细菌，或判断细菌的呼吸类型和运动性。

①细菌在固体培养基上的培养特征就是菌落特征。所谓菌落特征是由一个细菌繁殖起来的，由无数细菌组成的具有一定形态特征的细菌集团。不同的细菌菌落特征是不同的。包括其形态，大小，光泽，颜色，质地柔软程度，透明度等。菌落的特征是分类鉴定的依据。从三个方面观察菌落特征：（1）菌落表面的特征：光滑（S型，如肺炎链球菌，表面光滑，湿润，粘稠）还是粗糙（R型，如枯草芽胞杆菌，表面干燥，皱褶，平坦），干燥还是湿润等；（2）菌落的边缘特征：有圆形，边缘整齐，呈锯齿状，边缘伸出卷曲呈毛发状，边缘呈花瓣状等；（3）纵剖面特征：平坦，扁平，隆起，草帽状，脐状，乳头状等。

②细菌在明胶培养基中的培养特征。用穿刺接种法将某种细菌接种大明胶培养基中的培养培养，能产生明胶水解酶水解明胶，不同的细菌将明胶水解成不同形态的溶菌区，依据这些不同形态的溶菌区或溶菌与否可将细菌进行分类。

③细菌在半固体培养中的培养特征。用穿刺接种技术将细菌接种在含0.3%～0.5%琼脂半固体培养基中培养，细菌可呈现出各种生长状态，根据生长状态判断细菌的呼吸类型和鞭毛有无能否运动。

可依据生长状况判断细菌呼吸类型：如果细菌在培养基的表面及穿刺线的上部生长者为好氧菌。沿着穿刺线自上而下生长者为兼性厌氧菌或兼性好氧菌。如果只在穿刺线的下部生长者为厌氧菌。

可根据以下生长状况判断细菌是否在鞭毛，能否运动：如果只沿穿刺线生长者为无鞭毛不运动的细菌；如果不但沿穿刺线生长而且穿透培养基扩散生长者为有鞭毛，运动的细菌。

④细菌在液体培养基中的培养特征：在液体培养基中，细菌整个个体与培养基接触，可以自由扩散生长。它的生长状态随细菌属，种的特征而异。如枯草芽孢杆菌在肉汤蛋白胨培养基的表面长成无光泽，皱褶而粘稠的膜。

(3).细菌的单染色法涂片的制作

① 讲解细菌单染色法的染色原理及其规范化的操作方法。

② 结合无菌操作向学生演示细菌单染色涂片制作的完整操作过程，强调其操作基本要领。即：涂片时菌膜要求薄而均匀，干燥固定时温度不宜过高，染色时间充分，漂洗彻底。

③让学生通过无菌操作制作球菌，杆菌的单染色涂片各一张，并针对学生进行单独辅导。

（4）芽孢染色的实验步骤

①讲解细菌芽孢染色的原理及实验操作方法。

② 结合无菌操作向学生演示细菌芽孢染色涂片制作的完整操作过程，强调其操作基本要领。特别讲解芽孢染色的两种染色方法。

③让学生通过采用枯草芽孢杆菌制作涂片一张，提醒注意芽孢的着生位置及芽孢、营养体的颜色区别。

6、项目需用仪器设备名称：

7、所需主要元器件及耗材：

8、实验目的和任务：

（1）.掌握微生物无菌操作概念，正确树立“有菌环境，无菌操作”理念；

（2）.掌握细菌的培养特征及其应用；

（3）.掌握细菌单染色法基本原理，并通过无菌操作制作细菌的简易染色装片；

（4）.熟练掌握油镜的正确操作方法，并观察自制细菌简易染色装片。

编写责任人：    彭镰心               审核人：        邹亮        

编写时间：2011 年 8  月 28  日       审核时间： 2011 年 9  月 2日

实验项目三

1、实验项目名称：

细菌的革兰氏染色法。（本项目与实验项目二同时开设）

2、实验项目性质：

验证性。

3、实验要求：

必修。

4、学时数：

3学时。

5、实验内容：

(1).染色原理  革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 革兰氏染色法(Gram  stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可以将所有细菌分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成份和分子结构不同造成的。革兰氏阴性菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

(2).染色试剂  革兰氏染色液由四种不同的试剂构成：碱性染料 (basic  dyc)初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising  agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液一般是结晶紫（crystal  violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞壁之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细菌细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%乙醇（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染液的颜色，从而将细菌区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

(3).操作步骤 重点讲解在革兰氏染色操作中需注意的几个关键问题：

①作细菌革兰氏染色的细菌必需是经过活化新近培养的细菌，菌龄影响染色结果，如阳性菌培养时间过长或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

②作革兰氏染色时，作菌膜涂片时要求菌膜必需涂得薄而均匀，否则在染色过程中，对菌体初染，脱色，媒染，复染等操作有干扰，直接影响染色鉴定结果的准确性。

③革兰氏染色成败的关键在于严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染成阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染成阳性菌。

(4).观察提示  在显微镜高倍镜下对比观察革兰氏染色涂片，进行细菌革兰氏染色分类鉴定时应注意颜色的对比，不能机械地认为阳性菌一定是兰紫色，阴性菌一定是红色；而应根据两者对比的实际情况加以鉴定：一般阳性菌偏兰，偏紫色，阴性菌偏红色。对于颜色的辨别应以视野下游离的菌体染上的颜色作为颜色鉴定标准。

6、项目需用仪器设备名称：

7、所需主要元器件及耗材：

8、实验目的和任务：

(1).掌握细菌革兰氏染色法的染色原理，细菌革兰氏染色在细菌分类鉴定上的同的意义。

(2).掌握细菌革兰氏染色的操作方法，及操作技巧，并通过染色能正确地辨别出革兰氏阴性菌(G^-)和革兰氏阳性菌(G⁺) 。

编写责任人：    彭镰心               审核人：        邹亮        

编写时间：2011 年 8  月 28  日       审核时间： 2011 年 9  月 2日

实验项目四

1、实验项目名称：

放线菌的显微形态特征观察；霉菌的显微形态特征观察。（本项目与实验项目一同时开设）

2、实验项目性质：

验证性。

3、实验要求：

必修。

4、学时数：

3学时。

5、实验内容：

(1).放线菌的个体形态特征显微观察

①玻璃纸透析培养观察法观察放线菌显微形态特征及放线菌的菌落生长特征。

②对照放线菌的实验教学装片观察放线菌的显微形态特征

(2).各类霉菌的显微形态特征特征观察比较

①玻璃纸透析培养观察法观察各类霉菌的显微形态特征及菌落生长特征

②对照各类霉菌的实验教学装片观察各类霉菌的显微形态特征。

(3)实验结果

①按微生物规范作图法绘画出放线菌的显微形态特征图，并用文字阐述其个体形态特征。

②按微生物规范作图法绘画出所观察到的具有代表性的几类霉菌显微形态特征图，并用文字阐述其个体形态特征。

6、项目需用仪器设备名称：

7、所需主要元器件及耗材：

8、实验目的和任务：

（1）.掌握玻璃纸透析培养法培养霉菌及放线菌的实验原理，了解其操作的基本方法以及玻璃纸的消毒灭菌方法。

（2）.掌握四类霉菌（毛霉，根霉，青霉，曲霉）及放线菌的个体形态显微特征。并掌握和观察其各自的菌落生长特征。

编写责任人：    彭镰心               审核人：        邹亮        

编写时间：2011 年 8  月 28  日       审核时间： 2011 年 9  月 2日

实验项目五

1、实验项目名称：

酵母菌的形态观察及死，活细胞染色鉴定；微生物的显微镜直接计数法。

2、实验项目性质：

验证性。

3、实验要求：

必修。

4、学时数：

3学时。

5、实验内容：

(1).实验原理阐述：

①酵母菌死活细胞染色鉴定原理；

②血球计数板的构造原理及微生物的显微镜直接计数原理。

(2).实验操作：

①酵母菌的菌落特征观察；

②酵母菌的个体形态特征观察及死活酵母菌的鉴别。

(3).微生物的显微镜直接计数法：

①血球计数板的结构特征观察及计数室的镜检；

②血球计数板分类及微生物显微计数公式推导；

③酵母菌菌液的显微计数操作。

(3).实验结果阐述：

①根据观察的酵母菌的个体形态特征，绘画出酵母菌的个体形态特征图。

②绘制酵母菌染色前后，同一视野下的显微形态对比图。

③将酵母菌的显微计数结果填写到下表格中，并计算出实验检测结果。

微生物显微计数统计表

6、项目需用仪器设备名称：

7、所需主要元器件及耗材：

8、实验目的和任务：

（1）.掌握酵母菌的细胞形态特征及其出芽生殖方式的形态特征;了解其培养特征。

（2）.掌握酵母菌死，活细胞染色原理及染色方法；酵母菌死活细胞染色的意义。

（3）.掌握血球计数板的构造原理及正确的使用方法。

（4）.掌握微生物显微镜直接计数法原理及其操作方法；微生物显微计数的意义

编写责任人：    彭镰心               审核人：        邹亮        

编写时间：2011 年 8  月 28  日       审核时间： 2011 年 9  月 2日

实验项目六

1、实验项目名称：

微生物培养基的制备；消毒与灭菌。

2、实验项目性质：

验证性。

3、实验要求：

必修。

4、学时数：

4学时。

5、实验内容：

(1).实验原理

① 微生物培养基的配制原理:掌握营养琼脂与EMB培养基配制原理。

② 干热灭菌与高压蒸汽灭菌法灭菌原理，灭菌的相关参数。

(2).实验操作

①根据要求，配制相应的培养基（称量，溶解，测定pH值，分装）；

②掌握微生物常用器皿的灭菌包装方法；培养基的分装要求；

③ 高压蒸汽灭菌（重点阐述冷空气排放方法，灭菌参数选择）；

④试管固体培养基的斜面制作.

(3).结果观察

培养基（经24h,36±1℃ 无菌培养）（灭菌效果检测）。

6、项目需用仪器设备名称：

7、所需主要元器件及耗材：

8、实验目的和任务：

（1）.明确培养基的配制原理，了解培养基的分类及用途。

（2）.通过对牛肉膏蛋白胨培养基和乳糖胆盐发酵培养基的配制，掌握配制固体及液体培养基的一般方法和步骤。

（3）.掌握消毒与灭菌的本质区别;了解消毒与灭菌的常用方法。

（4）.掌握高压蒸汽灭菌法的灭菌原理和高压灭菌锅的正确的操作使用方法。

编写责任人：    彭镰心               审核人：        邹亮        

编写时间：2011 年 8  月 28  日       审核时间： 2011 年 9  月 2日

实验项目七

1、实验项目名称：

微生物的分离与纯化；微生物的接种。

2、实验项目性质：

验证性。

3、实验要求：

必修。

4、学时数：

4学时。

5、实验内容：

(1).实验原理阐述

①微生物分离纯化的目的与原理，具体阐述粪便中粪大肠菌的分离纯化原理与操作方法。

②微生物平皿划线分离法及平皿倾注分离法分离原理，重点阐述世界卫生组织（WHO）推荐的五区划线分离原理。

③微生物纯培养物的保存― 微生物菌种的接种原理

④微生物培养方式的选择，倒置培养的目的与意义。

(2).实验操作

①向学生演示世界卫生组织（WHO）推荐的五区划线，对粪大肠分离中EC肉汤培养呈阳性的试管，进行粪大肠菌的平皿划线分离操作。

②要求学生粪便中粪大肠菌的分离操作--微生物平皿划线分离法操作（每人限作一只平皿）

③用实验室提供的菌种，向学生演示试管斜面划线接种操作。

④学生用实验室提供的菌种，按教师示范操作，进行微生物接种操作（每人限作2支，作为成绩评定依据），在黑板上画出接种示意图。

⑤培养：将上述需培养的接种后的培养基，放入36±1 OC恒温培养箱中，经24±2h倒置培养后观察结果。

(3).实验结果

要求24小时后，回实验室观察各自的EMB平皿划线分离及斜面接种培养结果：

①粪便中粪大肠菌分离纯化观察：要求通过此步分离能够在EMB平皿上找到带有金属光泽，且呈现紫红色特征的单一的菌落。

②微生物接种成绩评定：2支合格为优，1支合格为良，两支均不合格的学生需即时登记补作。

6、项目需用仪器设备名称：

7、所需主要元器件及耗材：

8、实验目的和任务：

（1）.掌握微生物接种的目的，原理以及微生物斜面接种的操作方法。

（2）.掌握微生物分离纯化的目的、原理及常用的微生物分离纯化的方法。

（3）.重点掌握世界卫生组织（WHO）推荐的五区划线法进行平板划线分离分离原理和具体操作方法。

编写责任人：    彭镰心               审核人：        邹亮         

编写时间：2011 年 8  月 28  日       审核时间： 2011 年 9  月 2日