教学大纲介绍：
一、《生物化学实验Ⅱ》课程
（一） 本课程实验总体介绍
1、本课程实验的任务：
通过生物化学实验教学，应达到以下三个目的：其一：使学生做到理论与实践的统一，有目的引导学生把所学到的生物化学理论知识在实验中加以验证和应用，做到理论与实践紧密结合，体现生物化学实验教学的特色；其二是在实验教学中，教师以身作则，培养学生良好的实验习惯，树立实事求是的严谨科学作风；其三是让学生在掌握生物化学实验的基本原理基础上，全面掌握生物化学基本实验操作技能，为后续各专业基础课奠定坚实的物质基础。
2、本课程实验简介：
《生物化学Ⅱ实验》与其理论教学同步行课，但作为专业基础课独立考核。按照本科药学专业教学大纲规定，《生物化学Ⅱ实验》授课学时32学时（2学期），实验教学内容是在《生物化学Ⅰ实验》基础上，根据药学专业培养人才的需要，对《生物化学Ⅰ实验》的补充与深化。实验涉及酶、维生素、核酸、物质代谢等生物化学基础实验内容。一般实验为4学时，个别实验需8～12学时。
3、本课程适用专业：
本实验课面向生物工程 、制药工程、药学工程等本科学生开设。
4、本课程实验涉及核心知识点：
通过实验教学环节，正确引导学生把所学到的生物化学理论知识在实验中加以验证和应用，使学生对生物化学专业基础课所学理论知识在实践中得以重新认识、理解和深化。在实验教学环节中，加强对学生动手能力的培养；督促学生养成良好形为习惯，提高实验综合能力，培养造就具备综合性素质的应用性人才。
5、本课程实验重点与难点：
在确保为学生提供良好的实验条件和环境前提下，在现有生物化学实验设备资源有限条件下，尽最大可能，调动一切实验仪器设备资源，在实验实践操作环节中，保障有充足的仪器设备台套件数供学生独立操作使用。
在实验教学环节中，如何加强对学生动手能力的培养：让学生从掌握生物化学实验常规仪器设备结构原理基础入手，通过大量反复的操作实践训练，使学生不仅会按规范化操作程序独立操作、使用生化实验中常规仪器设备，而且要求学生掌握常规仪器设备的主要性能参数，并能简单维护仪器设备。
在实验教学环节中，督促学生养成良好形为习惯，提高实验综合能力，培养造就具备综合性素质的应用性人才。
（1）规范学生实验报告书写格式：用成都大学统一报告纸书写；每个实验必需写明实验名称，实验目的和原理；性质验证实验一般列表详述（应包括名称、操作简述、现象纪录、相关反应式、解释结论）；定量分析实验（即时登记实验真实数年数据、完整实验操作步骤、微机绘制标准曲线）；回答实验思考题。
（2）实验预习与试讲、考评相结合：要求学生在实验前，根据实验教学进度表预习实验内容，实验开始前，先由学生讲解实验原理及操作，然后再由实验指导教师进行评讲。督促学生自觉养成良好实验形为习惯。
（3）将实验规范操作作为学生实验成绩考核目标：在实验中，全程跟踪学生实验操作，评价学生实验操作，考查学生自行管理实验器皿情况，严格登记实验器皿的丢失、损坏记录。
（4）要求学生以严谨的治学态度对待每一次实验：所有定量分析实验数据均要求现场登记备案，在课后书写报告时，所引用数据必需真实。评价此类实验报告成绩时，不仅看实验数据的准确性，更看重实验数据的真实性。
6、考核方式：
实验报告成绩：60%；
期末理论考查：20%；
实验操作规范：10%；
课堂提问回答：10%。
7、总学时：
32学时
8、教材名称及教材性质：
《生物化学实验Ⅱ》
自编实验教学讲义
9、参考资料：
为了使实验教学大纲科学而严谨，在实验教学大纲编写中，主要参考和借鉴以下参考书目，在此对下述所列参考书目的编著者及其出版社一并表示衷心的感谢。
1. 北师大生物系生物化学教研室编写的·生物化学实验·北京：高等教育出版社
2. 刘粤梅、朱怀荣主编·生物化学实验教程·北京：人民卫生出版社
3. 王秀奇等主编的·基础生物化学实验·北京：高等教育出版社
4. 成都大学生物产业学院·苟小军、徐文俊合编·生物化学实验（自编教材）；
（二）包含实验项目基本信息
实验项目一
1、实验项目名称：
实验一 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
2、实验项目目的和任务：
（1）了解酵母核糖核酸的组分；
（2）掌握酵母核糖核酸的提取原理及操作方法；
（3）掌握核糖核酸各组分鉴定的原理与方法。
（4）通过提取酵母RNA为后续RNA定量测定实验提供实验材料。
3、实验内容：
（1） 酵母核糖核酸的提取操作：
酵母核酸中核糖核酸（RNA）含量较多。RNA可溶解于碱性溶液中，在碱性提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸（RNA）沉淀，由此即可得到RNA的粗制品。
（2） 核糖核酸各组分鉴定操作方法：
核糖核酸（RNA）分子中含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加入硫酸煮沸可使其水解，从RNA的水解液中可以测出上述各组分的存在。
A. 嘌呤碱的鉴定：用硝酸银沉淀法检测。
B. 核糖的鉴定：用地衣酚显色法测定。
C. 磷酸根鉴定：用定磷试剂检测。
4、项目需用仪器设备名称：
仪器设备名称 | 规格型号 | 单位 | 数量 |
冰箱 | KG22V11TI | 台 | 1 |
双列四孔水浴锅 | KXB-11AB | 台 | 6 |
普通台式离心机 | 80-2型 | 台 | 6 |
电子天平 | BS110S | 台 | 1 |
5、所需主要元器件及耗材：
主要耗材 | 单位 | 数量 |
酵母粉 | g | 200 |
苔黑酚试剂 | mL | 50 |
0.04mol/L的NaOH溶液 | mL | 1000 |
酸性乙醇溶液：（将0.3mL浓HCl加入到30mL乙醇溶液中） | mL | 500 |
95%乙醇 | mL | 1000 |
乙醚 | mL | 500 |
1.5mol/L H2SO4溶液 | g | 240 |
浓氨水 | mL | 120 |
0.1mol/L AgNO3 溶液 | mL | 120 |
FeCl3-浓HCl溶液 | mL | 120 |
苔黑酚乙醇溶液 | mLl | 60 |
酵母粉 | g | 180 |
定磷试剂 | mL | 120 |
定磷试剂1：17%硫酸溶液 | mL | 50 |
定磷试剂2：2.5%钼酸铵溶液 | mL | 50 |
6、学时数：
4学时
实验项目二
1、实验项目名称：
实验二 动物肝脏组织中DNA的分离与提取
2、实验目的和任务：
(1) 掌握用浓盐法从动物组织提取核酸的原理
(2) 掌握从动物组织中提取DNA的操作步骤及操作技能。
(3) 通过提取DNA，为后续DNA定量测定实验材料。
3、实验内容：
(1) 新鲜（或冰冻）猪脾低温预处理操作：
在冰盐浴中，将制得的猪脾匀浆进行SCC液处理，除去血水，抑制DNA酶活。
(2) 络合金属离子、抑制DNA酶活性：
将所得沉淀悬于5倍体积的pH8.0 0.15mol/L NaCl-0.1mol/L Na2EDTA溶液中。边搅拌边慢慢滴加5% SDS，直至SDS最终浓度达1%为止。
(3) DNA的溶解与RNA分离：
加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅60min，以确保氯化钠全溶。
(4) 蛋白质的变性沉淀与DNA的分离：
加入同体积氯仿-异戊醇，激烈振荡20min，4000r/min离心20min，上层水相取出后倒入烧杯，以同体积氯仿-异戊醇重复去蛋白，直至界面处不再出现蛋白质凝胶为止。
(5) DNA钠盐的析出：
取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，再用95%乙醇洗一次，取出并挤干，制得DNA钠盐的粗制品。
4、项目需用仪器设备名称：
仪器设备名称 | 规格型号 | 单位 | 数量 |
冰箱 | KG22V11TI | 台 | 1 |
高速组织捣碎机 | JJ-2型 | 台 | 1 |
大容量高速离心机 | | 台 | 1 |
普通台式离心机 | 80-2型 | 台 | 6 |
电子天平 | BS110S | 台 | 1 |
5、所需主要元器件及耗材：
主要耗材 | 单位 | 数量 | 说明 |
20×SSC 母液 | mL | 1000 | |
NaCl-Na2EDTA溶液 | mL | 800 | |
95%乙醇 | mL | 1000 | |
5% SDS （5g SDS溶于100ml 45%乙醇） | mL | 800 | |
氯仿-异戊醇混合溶液：氯仿:异戊醇=24:1（体积比） | mL | 2000 | |
粗盐（制冰盐浴用） | g | 1000 | |
6、学时数：
6学时
实验项目三
1、实验项目名称：
实验三 地衣酚Cu2+显色法测定酵母RNA含量
2、实验目的和任务：
（1） 掌握地衣酚定糖法测定RNA的原理和方法，了解其试剂组成及配制方法；
（2） 熟练掌握7200型分光光度计的基本结构及其正确的操作使用方法；
（3） 熟练掌握RNA标准曲线的制作方法，并通过回归方程计算未知RNA含量。
3、实验内容：
（1） 用地衣酚定糖法定量测定标准RNA，绘制标准曲线：用分光光度仪在A670nm处测定标准RNA液各对应浓度下的OD值，按统计学方法，最终确定回归方程；通过回归方程，计算待测RNA含量；
（2） 准确称量，配制未知RNA样品待测液（100～200ug/mL）25mL；
（3） 画出地衣酚定糖法测定标准RNA的标准曲线；
（4） 用地衣酚定糖法定量测定未知RNA 的OD值，代入回归方程，计算酵母RNA的百分含量。
4、项目需用仪器设备名称：
仪器设备名称 | 规格型号 | 单位 | 数量 |
7200型分光光度计 | WF-J2型 | 台 | 6 |
电子天平 | BS110S | 台 | 1 |
双列四孔水浴锅 | KXB-11AB | 台 | 6 |
5、所需主要元器件及耗材：
主要耗材 | 单位 | 数量 | 说明 |
RNA标准品（1g/瓶） | 瓶 | 2 | |
地衣酚试剂 | mL | 500 | |
6、学时数：
2 学时
实验项目四
1、实验项目名称：
实验四 二苯胺显色法测定动物肝脏组织中的DNA提取物含量
2、实验目的和任务：
（1） 掌握二苯胺显色法定量测定猪脾DNA含量的原理和方法，了解其试剂组成及配制方法；
（2） 熟练掌握7200型分光光度计的基本结构及其正确的操作使用方法；
（3） 熟练掌握DNA标准曲线的制作方法，并通过回归方程计算猪脾DNA含量。
3、实验内容：
（1） 用二苯胺显色法定量测定标准小牛胸腺DNA钠盐不同浓度下对应的OD值，绘制标准曲线：按统计学方法，最终确定回归方程；
（2） 准确称量，配制未知DNA样品待测液（100～200ug/mL）25mL；
（3） 画出二苯胺显色法测定标准小牛胸腺DNA钠盐的标准曲线；
（4） 用二苯胺显色法定量测定猪脾DNA的OD值，代入回归方程，计算猪脾DNA的百分含量。
4、项目需用仪器设备名称：
仪器设备名称 | 规格型号 | 单位 | 数量 |
7200型分光光度计 | WF-J2型 | 台 | 6 |
电子天平 | BS110S | 台 | 1 |
双列四孔水浴锅 | KXB-11AB | 台 | 6 |
5、所需主要元器件及耗材：
主要耗材 | 单位 | 数量 | 说明 |
DNA标准品 （1g/瓶） | 瓶 | 2 | |
二苯胺试剂 | mL | 250 | 二苯胺试剂 |
6、学时数：
2学时
实验项目五
1、实验项目名称：
实验五 小麦萌发前后淀粉酶活力测定
2、实验目的和任务：
1. 掌握从小麦、麦粒中提取淀粉酶的原理和操作方法；
2. 掌握用3、5-二硝基水杨酸法测定淀粉酶活力的原理与方法；
3. 掌握酶活单位的概念以及本实验对淀粉酶酶活单位的定义；
4. 通过测定二者活性大小的比较，说明淀粉酶在小麦萌发过程中的生理意义。
3、实验内容：
（1） 根据小麦萌发前后淀粉酶活力的变化规律，让学生准备实验材料：
提前3～4天对休眠小麦进行萌发：麦粒浸泡2～3小时后，用干净湿润细砂或湿润的纱布掩埋或包裹麦粒，在25～28oC温度下进行萌发，每隔12h换水一次，休眠麦粒只在实验前3～4h浸泡即可；
（2） 小麦萌发前后淀粉酶提取方法；
（3） 小麦萌发前后淀粉酶活力测定：淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。
2 (C6H10O5) n +nH2O nCl2H22O11
麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3—氨基5—硝基水杨酸。后者可用分光光度计法测定。
（4） 小麦萌发前后淀粉酶活力计算
根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准/A未知 = C标准/C未知，则C（酶液管中麦芽糖的浓度）= A未知 × C标准/A 标准。
式中：C为浓度；A为光吸收值。
本实验规定：25℃时3分钟内水解淀粉释放１mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位。则15粒种子或15株幼苗的总活力单位= C酶×n酶×V酶
式中：C酶为酶液中麦芽糖的浓度；n酶为酶液稀释倍数；V酶为提取酶液的总体积。
4、项目需用仪器设备名称：
仪器设备名称 | 规格型号 | 单位 | 数量 |
7200型分光光度计 | WF-J2型 | 台 | 6 |
恒温恒湿种子萌发培养箱 | | 台 | 1 |
台式离心机 | 800型 | 台 | 6 |
4孔恒温水浴锅 | HH-4型 | 台 | 6 |
5、所需主要元器件及耗材：
主要耗材 | 单位 | 数量 | 说明 |
优质小麦种子 | g | 100 | |
3、5-二硝基水杨酸试剂 | mL | 300 | |
6、学时数：
4 学时
实验项目六
1、实验项目名称：
实验六 肌糖元的酵解
2、实验目的和任务：
（1）掌握肌糖元酵解作用的原理及酵解作用产生的条件及代谢途径。
（2） 掌握测定肌糖元代谢终产物的验证反应原理和操作方法。
（3）了解糖元酵解作用在糖代谢过程中的生理意义。
3、实验内容：
（1）处死动物和制备肌肉糜：
研究机体的新陈代谢首先要注意使所测得结果尽量符合机体的真实情况。杀死动物的方法对于获得真实情况有着直接关系；
将动物（鼠和兔）杀死后，放血，立即割取背部肌肉，在低温条件下用剪刀尽量把肌肉剪碎即成肌肉糜，低温保存备用。
（2）肌肉糜的糖酵解：
肌糖元的酵解作用，即肌糖元在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的糖元首先与磷酸化合而分解，经过己糖磷酸脂，丙糖磷酸脂，丙酮酸等一系列中间产物，最后生成乳酸的过程。
（3）肌肉糜的糖酵解产物-乳酸的鉴定：
糖元或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者与对羟基联苯试剂反应产生紫红色物质，根据颜色的显现而加以鉴定。
4、项目需用仪器设备名称：
仪器设备名称 | 规格型号 | 单位 | 数量 |
冰箱 | KG22V11TI | 台 | 1 |
四孔恒温水浴锅 | HH-4型 | 台 | 6 |
电子天平 | BS110S | 台 | 1 |
5、所需主要元器件及耗材：
主要耗材 | 单位 | 数量 | 说明 |
新鲜的动物肌肉组织 | g | 200 | |
1/15 mol/L的 pH=7.4的磷酸缓冲溶液 | mL | 300 | |
1.5% 对羟基联苯试剂 | mL | 300 | |
98%硫酸、液体石腊等各 | mL | 300 | |
15% 偏磷酸溶液 | mL | 240 | |
1/15 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.4） | mL | 240 | |
0.5% 糖元溶液（或0.5% 淀粉溶液） | mL | 240 | |
液体石腊 | mL | 240 | |
饱和硫酸酮溶液 | mL | 240 | |
6、学时数：
4 学时
实验项目七
1、实验项目名称：
实验七 蔗糖酶的分离与纯化
2、实验目的和任务：
（1）掌握蔗糖酶提取的原理及方法；
（2）掌握有机溶剂分级沉淀法分离提纯蔗糖酶的原理和操作方法；
（3）掌握离子交换柱层析法分离提纯蔗糖酶的原理和操作方法；
（4）掌握蔗糖酶活力测定、比活测定的原理和方法。
3、实验内容：
（1）葡萄糖标准曲线和牛血清蛋白标准曲线的制作：
采用3,5二硝基水杨酸显色法测定葡萄糖标准曲线，确定回归方程；采用Folin—酚法测定牛血清蛋白标准曲线，确定回归方程。
（2） 蔗糖酶的分离提纯：
A. 蔗糖酶粗品的制备；
B. 乙醇分级和透析法分离纯化蔗糖酶；
C DEAE—纤维素柱层析法分离纯化蔗糖酶。
（3） 蔗糖酶活力及蛋白浓度的测定：
A 蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。
B 蔗糖酶活力测定：分别取上述各阶段提取的酶配制制成适宜的酶稀释液，用此酶液催化蔗糖水解，再采用3,5二硝基水杨酸显色法测定水解生成的还原糖的量，计算出各阶段提取的酶活大小。
蔗糖酶活力单位 ＝ 葡萄糖毫克数 × 9 × 酶的稀释倍数
C 酶蛋白浓度及比活的测定：用Folin—酚法测定各阶段提取纯化到的酶蛋白质浓度，计算出各阶段提取纯化的酶比活的大小。
4、项目需用仪器设备名称：
仪器设备名称 | 规格型号 | 单位 | 数量 |
冰箱 | KG22V11TI | 台 | 1 |
台称 | BS110S | 台 | 3 |
双列四孔水浴锅 | KXB-11AB | 台 | 4 |
普通台式离心机 | 80-2型 | 台 | 8 |
7200型分光光度计 | WF-J2型 | 台 | 6 |
血糖管 | 25mL | 支 | 24 |
5、所需主要元器件及耗材：
主要耗材 | 单位 | 数量 | 说明 |
活性干酵母粉 | g | 500 | |
2mg / mL 标准葡萄糖溶液 | mL | 1000 | |
标准牛血清蛋白溶液（200ug/mL） | mL | 500 | |
5％的蔗糖溶液 | mL | 1000 | |
含0.30mol／L NaCl的0.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液 | mL | 2000 | |
3,5二硝基水杨酸试剂 | mL | 1000 | |
0.03mol／L，pH7.8的磷酸钠缓冲液 | ml | 2000 | |
Folin试剂甲（俗称碱性铜试剂） | mL | 500 | |
Folin试剂乙 | mL | 2000 | |
0.5mol／L和1mol／L的NaOH溶液 | mL | 500 | |
0.5mol／L的HCl | mL | 500 | |
20％的醋酸 | mL | 500 | |
95％乙醇 | mL | 1000 | |
透析袋 | m | 4 | |
甲苯 | mL | 1000 | |
6、学时数：
10 学时
执笔人：徐文俊 系主任：王跃华
主管教学院长：刘达玉填报日期：2009-6-2
备注（本教学大纲从2008-2009学年第2学期开始执行）
