《微生物学实验》教学大纲

课程代码：05420200

课程名称：微生物学实验

课程学分：1.5                              课程学时：24（理论学时：4学时 实践学时：20学时）

课程性质：学科必修课          课程归属：科学素养类

开课部门：生物工程学院        建议修读学期：第4学期

适用对象：本实验属于专业基础实验，面向生物产业学院生物工程、制药工程、药学、食品科学工程、食品质量与安全各本科专业学生开设。

«    课程概况

n        教学目的

       微生物学实验课的目的在于通过一系列实验项目，使学生能比较熟练地掌握微

生物学实验的操作方法和技能；学会进行综合实验的设计、准备、操作和结果分析；培

养学生对实验原理、方法和结果的正确理解，仔细观察，认真思考的科学素养和分析问

题和解决问题的科学能力.

n        课程地位

    微生物学实验是一门实践性课程，是与微生物学课程配套的实验教学，通过本课程的教学，验证《微生物学》课堂理论，培养学生的观察能力、动手能力、实践操作能力和辩证思维能力，为今后从事教学、科研和生产工作打下扎实基础。微生物学实验作为基础性实验，主要培养学生对微生物的基础认识几基础操作，其后续课程将会结合专业特点，进一步开设相关实验课程与项目。

n        学时分配

（实验类别包括演示、验证、应用、综合、设计、研究、创新）

«    教学内容及要求

n        1.普通光学显微镜的结构及其使用，霉菌、放线菌形态观察

u       实验目的和要求

（1）熟习普通光学显微镜的构造及各部分的功能。

（2）学习并掌握油镜的放大原理和使用方法。

u       主要实验方法

（1）操作前的准备

 ①置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3～4cm 。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼，使其均能观察。

 ②调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈，升降聚光器，旋转反光镜调节光线强弱。

（2）低倍镜观察

  检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。

将霉菌（放线菌或枯草芽孢杆菌）标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜下降至距离标本约0.5cm处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到需观察的目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清晰为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。

（3）高倍镜观察

  将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察。避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。

（4）油镜观察

①用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。

②在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

③从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，镜头几乎与标本接近，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。

④从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器较正焦距。如油镜已离开油面而仍不见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像清晰为止。

⑤用同样方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。

⑥观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，然后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

⑦将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

n        3. 细菌的单染色法、革兰氏染色法、芽孢染色法

u       实验目的和要求

（1）掌握细菌不同染色法的染色原理和实验操作方法。

（2）掌握微生物无菌操作的原理和操作技巧。

（3）熟练掌握显微镜的使用方法。

u       主要实验方法

单染色法：

（1）涂片: 取两块干净的载玻片, 各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作，具体操作方法详看下面4-1图的涂片、干燥和固定及图4－2的无菌操作示意图。

（2）干燥: 于室温下自然干燥。 

（3）固定: 涂片面向上，于火焰上通过2-3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则，细菌形态将毁坏。

（4）染色: 放标本于水平位置，滴加染色液于菌膜上，染色时间长短随染色液而定。吕氏碱性美蓝液约染2～3分钟，石炭酸复红染1～2分钟。

（5）水洗: 染色时间到后,用自来水冲洗,直至冲下之水无色为止。注意冲洗时水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗完毕后，将玻片标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置于油镜观察。

（6）镜检: 按实验一的操作方法进行显微镜观察。

革兰氏染色法：

（1）涂片： 将培养14～16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意在涂片操作时,菌膜切不涂得可过于浓厚)，干燥，固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

（2）染色:

  ①初染： 加草酸铵结晶紫一滴于菌膜上，约一分钟后用水冲洗。

 ②媒染： 滴加碘液冲去菌膜上的残水,并覆盖一分钟，水洗。

 ③脱色： 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景,用95%乙醇滴洗至流出乙醇刚刚不出现紫色为止，约需20～30秒，立即用清水冲净乙醇。

 ④复染： 用番红染液染1～２分钟,水洗。

 ⑤镜检：  干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。观察时以分散开的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

 ⑥用同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌分别制片，对比染色。

芽孢染色法：

  (1) 用培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作菌膜涂片，干燥，固定。

   (2) 滴加3～4滴孔雀绿染液覆盖于已固定的菌膜涂片上。

   (3) 用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4～5分钟。这一步也可以不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染10分钟。

   (4) 倾去染液,待玻片冷却后，用水冲洗玻片至菌膜不再褪色为止。

   (5) 用番红水溶液复染1分钟,水洗。

   (6) 待干燥后，置油镜下观察，芽孢应呈绿色，菌体应呈红色。

n        4. 酵母菌的形态观察及死，活细胞染色鉴定；显微镜直接计数法

u       实验目的和要求

        （1）掌握酵母菌的细胞形态特征及其出芽生殖方式的形态特征。

        （2）学习掌握区分酵母菌死，活细胞的染色原理及染色方法。

        （3）掌握微生物显微镜直接计数法的计数原理及其操作方法。

        （4）掌握血球计数板的构造原理，及其进行微生物计数的原理和使用方法。

        （5）了解微生物数量测定的常用方法及微生物生长指标有哪些？

u       主要实验方法

(1) 在载玻片中央加一滴0.1%吕氏美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养48小时的酿酒酵母菌少许，放在吕氏美蓝碱性染液中，使菌体与染液均匀混合。

(2) 用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将整个盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边先与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。

(3) 将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区分死，活细胞。

(4) 染色半小时后，再观察一下死酵母菌细胞数目是否有所增加。

(5) 再用0.05%吕氏美蓝染液重复上述的操作。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格,而每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数目都是相同的，即16 x 25 = 400个小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。

   在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

   下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则一个大方格中的总菌数（即0.1mm3中的总菌数目）为(A 25 x B)/5，因 1mL= 1cm3 = 1000mm3，故1mL菌液中的总菌数 = (A/5) ×25× 10×1000×B = 50000A x B (个)。   同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为C，则：

   1ml菌液中的总菌数 =(C/5)×16×10×1000 B = 32000 C x B (个)

n        2. 培养基的制备和灭菌

u       实验目的和要求

      ⑴明确培养基的配制原理，了解培养基的分类及用途。

      ⑵通过对牛肉膏蛋白胨培养基和乳糖胆盐发酵培养基的配制，掌握配制固体及液体培养基的一般方法和步骤。

      ⑶掌握消毒与灭菌的本质区别;了解消毒与灭菌的常用方法。

      ⑷掌握高压蒸汽灭菌法的灭菌原理和正确的操作方法。

u       主要实验方法

       培养基的配制：

    ⑴称量 按肉汤蛋白胨和乳糖胆盐发酵培养基的配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl，乳糖，牛胆盐，量取溴甲酚紫指示剂等药品或试剂分别放入有刻度的搪瓷量杯中（培养基配方请参见本书附录）。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙取用一种药品;或称取一种药品后洗净，擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

    ⑵溶化 在上述烧杯中可先加入少许所需要的开水，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防止琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失水分。

    ⑶调节pH值 在未调节pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH试剂，边加边搅拌，并随时选用pH试纸测其pH值，直至pH达到7.6 。反之用1mol/L HCl试剂进行调节。注意pH值不要过头，以避免回调，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求较精密的微生物，其pH的调节可用酸度计进行调节。

    ⑷过滤 趁热用滤纸或多层布过滤，以利于结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。

    ⑸分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或三角瓶口上，以免污染棉塞引起污染。

①液体分装   分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

②固体分装   分装试管，其装量不超过试管高度1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。

③半固体分装 试管一般以试管1/3高度为宜，灭菌后垂直待凝。

    ⑹加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附在本实验后面）。

    ⑺包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一条麻绳捆扎好。用记号笔注明培养名称，组别及制作日期。三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称，组别及制作日期。

培养基的高压蒸汽灭菌：

    ⑴首先将手提式高压灭菌锅内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

    ⑵放回灭菌桶，并放入上述包扎好，需灭菌的培养基。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

    ⑶加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对应的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

    ⑷用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内温度随蒸汽压力增加逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验所制备的培养基在压力为1.05kg/cm2 ,温度为 121.3℃状态下,维持20分钟进行灭菌。

    ⑸灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降到0时，打开排气阀，排尽余汽,旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌后的培养基。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

    ⑹将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度不超过试管总长度的一半为宜。

    ⑺将取出凝固的灭菌培养基放入37℃的恒温培养箱中，无菌培养24小时后取出，检查培养基表面有无杂菌生长，如有证明灭菌不合格，需再次进行灭菌。若无则可将灭菌合格培养基放置于电冰箱的冷藏室中贮存备用。

    ⑹项目需用仪器设备名称：

高压灭菌锅

n        5. 酵母菌的形态观察及死，活细胞染色鉴定；显微镜直接计数法

u       实验目的和要求

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术

u        主要实验方法

    ⑴简易单细胞挑取法

它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂斤，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。

    ⑵平板分离法

该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面：

①选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

②微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用三种不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。

«    课程考核

n        考核方式 考查

n        考核形式 以学生报告、期末实验理论试卷考查及操作和课堂提问等方式综合评定。

n        成绩评定 实验报告60%、期末理论成绩30%、实验操作、出勤10%。

«    教学材料

n        教材

n        《微生物学实验》自编教材，成都大学生物产业学院，徐文俊。

n        主要参考资料

  （1）《微生物学实验》，沈萍，陈向东，高等教育出版社，2012

  （2）《微生物学实验》，袁丽红，化学工业出版社，2010年。

                 撰写人：彭镰心                                                    审核人：